小鼠型纖溶酶原激活物（uPA）檢測試劑盒說明書

中文名稱：小鼠型纖溶酶原激活物（uPA）檢測試劑盒

存儲條件：4℃保存

有 效 期：6個月

產品規格：96T/48T

適用范圍：此試劑盒僅用于科研實驗，嚴禁用于臨床。

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。

2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。

3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到

100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在di一、第二孔中分別加標準品100μl，然后在di一、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從di一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為180 ng/L，120 ng/L ，60 ng/L，30 ng/，15 ng/L）。

2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4. 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7. 溫育：操作同3。

8. 洗滌：操作同5。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

11. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘。

     血漿樣本直接測定前處理方法：

（1）加酶抑制劑：準確采全血若干毫升，注入預冷的加有抗凝劑的塑料指形管中，迅速低溫離心，取血漿低溫保存待測。有液體的與固體的。固體的可用生理鹽水溶解。

（2）酸化處理：每毫升血漿加1mol/l HCl 0.2ml，低溫保存待測。以上兩種方法，任選一種即可。

血漿樣本的間接測定 血標本經提取后，可去除蛋白質等干擾因素，并使微量的生物活性肽濃縮，但較費時，成本也高。常用的提取方法有：

（1）柱層析提取法：有多種層析柱可供提取不同的神經肽，其中較為方便的是用Sep-pak C18層析柱提取。主要步驟：

①柱的預處理：該柱有兩頭，長頭連接注射器，可注入溶液與樣品，短頭為排出口。預處理時注入乙腈10ml。蒸餾水20ml，使柱中的生物膠活化。

②注入樣品（如血漿、腦脊液、腹水、尿等）：樣品中的水份流出，生物活性肽、蛋白及雜質等吸附在生物膠上。血漿上柱前，如先去除蛋白，可增加柱子的使用時間。

③淋洗：用4%HAC溶液100ml注入柱中，以洗去一些雜質。

④洗脫：用7ml酸性乙腈作為洗脫劑，注入柱中，把生物活性肽洗脫下來，收集在塑料指形管中。

⑤清洗：用乙腈、蒸餾水清洗柱子，以備后用。

⑥將洗脫液吹干，低溫保存待測。測定時可加入一定量的緩沖液溶解。

注意事項

1. 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

2. 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

3. 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間好控制在5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。

4. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

5. 底物請避光保存。

6. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.

7. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

8. 本試劑不同批號組分不得混用。

9.如需代測或者樣本暫時不測定，可立即低溫凍存，溫度越低越好，中間避免反復凍融，-20℃以下可保存三個月,-70℃以下可保存六個月。

10.試劑使用須知：

11.（1）請參照相關法規、文獻、MSDS等信息，理解并掌握好試劑的特性，再進行安全操作。

12.（2）通常購買試劑時一定要想到一次性用完。若估算不足有剩余的話，更加注意其他保管和管理。

13.（3）萬一試劑操作者并非專業技術人員。必須在專業人士的指導監督下進行操作。對于使用后的廢棄物，不要或者舊的試劑，應按照相關法律法規正當處理。

14.（4）購買后，請務必確認標簽上的注意事項；做好預防顛倒，摔壞的措施和管理體制；在使用前再次確認標簽上的注意事項，做好必要的安全對策；對沒有標明其危害特性、有害特性的，也要慎重地進行操作；必須帶好防護用具，小心翼翼進行操作。